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流式细胞仪

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流式细胞仪(Flow cytometer )是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量,并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。

流式细胞仪

流式细胞仪的基本结构

流式细胞仪(Flow cytometer )是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量,并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。那么流式细胞仪的结构是什么呢?下面就让小编带你了解一下吧。

组成

流式细胞仪主要由四部分组成。它们是:流动室和液流系统;激光源和光学系统;光电管和检测系统;计算机和分析系统。

流动室和液流系统

流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成,常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细,是液流系统的心脏。样品管贮放样品,单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出;鞘液由鞘液管从四周流向喷孔,包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液,一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用,被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体,受到振荡信号可发生振动。

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激光源和光学系统

经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光;激光器又以氩离子激光器为普遍,也有配和氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是最常用的弧光灯,其发射光谱大部分集中于300~400nm,很适合需要用紫外光激发的场合。氩离子激光器的发射光谱中,绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强,约占总光强的80%;氪离子激光器光谱多集中在可见光部分,以647nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上,可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份,可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料激光器,则可得到550~650nm连续可调的激光,尤在590nm处转换效率最高,约可占到一半。为使细胞得到均匀照射,并提高分辨率,照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。光斑直径d可由下式确定:d=4λf/

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流式细胞仪的样品分选原理

流式细胞仪(Flow cytometer )是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量,并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器,它只能测量一个细胞的诸如总核酸量,总蛋白量等指标,而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说,它的细节分辨率为零。下面就让小编简单介绍一下流式细胞仪的分选原理。

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流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是:由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴,根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选,而后由充电电路对选定细胞液滴充电,带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转,落入收集器中;其它液体被当作废液抽吸掉,某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。

稳定的小液滴是由流动室上的压电晶体在几十KHz的电信号作用下发生振动而迫使液流均匀断裂而形成的。一般液滴间距约数百μm。实验经验公式f=v/4.5d给出形成稳定水滴的振荡信号频率。其中v是液流速度,d为喷孔直径。由此可知使用不同孔径的喷孔及改变液流速度,可能会改变分选效果。使分选的含细胞液滴在静电场中的偏转是由充电电路和偏转板共同完成的。充电电压一般选+150V,或-150V;偏转板间的电位差为数千伏。充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的,因此从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间,一般为数十ms。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键,仪器多采用移位寄存器数字电路来产生延迟。可根据具体要求予以适当调整。


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如何操作流式细胞仪

流式细胞仪(Flow cytometer )是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量,并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。下面就让小编简单介绍一下流式细胞仪的操作和操作时的注意事项。

仪器的操作和使用

①打开电源,对系统进行预热;

②打开气体阈,调节 压力,获得适宜的液流速度;开启光源冷却系统;

③在样品管中加入去离子水,冲洗液流的喷嘴系统;

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④利用校准标准样品,调整仪器,使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上,0和90散射的荧光强度最强,并要求变异系数为最小;

⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等,在同样的工作条件下测量样品和对照样品;同时选择计算机屏上数据的显示方式,从而能直观掌握测量进程;

⑥样品测量完毕后,再用去离子水冲洗液流系统;

⑦因为实验数据已存入计算机硬盘(有的机器还备有光盘系统,存贮量更大),因此可关闭气体、测量装置,而单独使用计算机进行数据处理;

⑧将所需结果打印出来。

操作和使用中的注意事项

1)光电倍增管要求稳定的工作条件,暴露的较强的光线下以后,需要较长时间的“暗适应”以消除或降低部分暗电流本底才能工作;另外还要注意磁屏蔽;

2)光源不得在短时间内(一般要1h左右)关上又打开;使用光源必须预热并注意冷却系统工作是否正常;

3)液流系统必需随时保持液流畅通,避免气泡栓塞,所使用的鞘流液使用前要经过过滤、消毒;

4)注意根据测量对象的变换选用合适的滤片系统、放大器的类型等;

5)特别强调每次测量都需要对照组。


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流式细胞仪的技术参数和应用

流式细胞仪(Flow cytometer )是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量,并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。下面让小编带你简单了解一下流式细胞仪的技术参数和应用。

技术参数

指标

为了表征仪器性能,往往根据使用目的和要求而提出几个技术参数或指标来定量说明。对于流式细胞仪常用的技术指标有荧光分辨率、荧光灵敏度、适用样品浓度、分选纯度、可分析测量参数等。

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荧光分辨率

强度一定的荧光在测量时是在一定道址上的一个正态分布的峰,荧光分辨率是指两相邻的峰可分辨的最小间隔。通常用变异系数(C。V值)来表示。C。V的定义式为:

C.V=σ/μ

式中,σ为标准偏差,μ是平均值。

在实际应用中,我们使用挖关系式σ=0。423FWHM;其中FWHM为峰在峰高一半处的峰宽值。现在市场上仪器的荧光分辨率均优于2。0%。

荧光灵敏度

反映仪器所能探测的最小荧光光强的大小。一般用荧光微球上所标可测出的FITC(fluorescein isothiocyanate 异硫氰基荧光素)的最少分子数来表示。现在市场使用仪器均可达到1000左右。

分析速度/分选速度

仪器每秒种可分析/分选的数目。一般分析速度为5000~10000;分选速度掌握在1000以下。

样品浓度

主要给出仪器工作时样品浓度的适用范围。一般在1010细胞/ml的数量级。

其它技术参数尚多,不再一一介绍。

应用

1。分析细胞表面标志

2.分析细胞内抗原物质

3.分析细胞受体

4.分析肿瘤细胞的DNA、RNA含量

5。分析免疫细胞的功能 


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流式细胞技术介绍

流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中测得多个参数,具有速度快、精度高、准确性好的优点,是当代最先进的细胞定量分析技术之一。

光源、液流通路、信号检测传输和数据的分析系统是流式细胞仪的主要组成。目前临床中运用流式细胞仪进行外周血白细胞、骨sui细胞以及肿瘤细胞等的检测是临床检测的重要组成部分。

流式细胞技术(flow cytometry,FCM)是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物。

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基本结构

流式细胞仪由三部分构成

1.液流系统,包括流动室和液流驱动系统;

2。光学系统,包括激发光源和光束收集系统;

3。电子系统,包括光电转换器和数据处理系统。流式细胞仪的工作原理是使悬浮在液体中分散的经荧光标记的细胞或微粒逐个通过样品池,同时由荧光探测器捕获荧光信号并转换成分别代表前向散射角、侧向散射角和不同荧光强度的电脉冲信号,经计算机处理形成相应的点图,直方图和加三维结构图像进行分析。

用于FCM的样本是单细胞悬液,可以是血液、悬浮细胞培养液、各种体液、新鲜实体瘤的单细胞悬液以及石蜡包埋组织的单细胞悬液等。

基本原则

1.使各种液体和悬浮细胞样本新鲜,尽快完成样本制备和检测;2.针对不同的细胞样本进行适当洗涤、酶消化或EDTA处理,以清除杂质,使粘附的细胞彼此分离而形成单细胞状态;3.对新鲜实体瘤组织可选用或联用酶消化法,机械打散法和化学分散法来获得足够数量的单细胞悬液;4.对石蜡包埋组织应先切成若干40-50um厚的蜡片,经二甲苯脱蜡到水后,再用前述方法制备单细胞悬液;5.单细胞悬液的细胞数不应少于10000个。

流式细胞技术的应用:

1.其测定细胞内DNA的变异系数最小,一般在2%以下;

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